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Frequently Asked Question

Learn in Brief

Suspension Culture Overview

Suspension culture involves culturing tissue and cells in a liquid medium, resulting in a suspension of single cells or cell clusters. This technique is commonly used in cell biology and biotechnology for cell line maintenance, recombinant protein production, and studying cell physiology and metabolism. Suspension cultures grow faster than callus cultures and require weekly subculturing.

Types of Suspension Culture

1. Batch Culture: A closed system where no materials are added or removed during culturing. The medium and cellular composition change over time, leading to a stationary growth phase due to toxic metabolite accumulation. Types include slow-rotating, shaker, spinning, and stirred cultures.

2. Continuous Culture: An open system where old medium is continuously replaced with new medium to maintain cell growth. Types include chemostat and turbidostat.

Steps in Suspension Culture

1. Selection of Explant: Choose young plant tissue as the explant.

2. Sterilization and Isolation: Ensure the explant is contamination-free.

3. Initial Stage of Cell Suspension: Transfer friable calli from solid to liquid medium.

4. Shake the Suspension: Place friable calli in a conical flask on a shaker at 100-250 rpm.

5. Filter the Suspension: After 7 days, filter the contents to obtain free cells or cell aggregates.

6. Growth of Suspension: Monitor cell multiplication using a haemocytometer.

7. Production: Tailor the suspension culture for specific research purposes, such as metabolite production.

Applications and Importance

1. Production of therapeutic proteins, antibodies, vaccines, and bioactive compounds.

2. Studying cellular processes, drug screening, and toxicity testing.

3. Propagation and maintenance of cell lines.

4. Platform for genetic engineering and recombinant protein expression.

5. Applicable to mammalian, microbial, bacterial, yeast, and fungal cells.

Advantages

1. Easily scalable.

2. Simple monitoring of growth, viability, and metabolic activity.

3. Continuous nutrient adjustment.

4. Genetically stable cell lines.

5. Homogeneous cell populations.

Disadvantages

1. Shear stress from mechanical agitation.

2. Loss of tissue-specific functions.

3. Risk of excessive foaming.

4. Higher contamination risk.

5. More expensive and complex media.

6. Limited study of cell-to-cell interaction.

Factors Affecting Suspension Culture

1. Proper agitation to avoid shear stress.

2. Suitable culture vessel and size.

3. Optimal medium composition.

4. Controlled temperature and pH.

5. Adequate gas exchange and oxygenation.

6. Effective contamination control.

7. Appropriate culture duration to maintain productivity and viability.

Learn in Hindi

जैसा कि आप जानते हैं कि पादप ऊतक संवर्धन को पादप-पूर्व वृद्धि के आधार पर दो भागों में विभाजित किया जाता है, जो हैं कैलस संवर्धन और निलंबन संवर्धन।

निलंबन कल्चर 

तरल माध्यम में संवर्धित ऊतक और कोशिका एकल कोशिकाओं और कुछ से लेकर कई कोशिकाओं के स्तंभों का निलंबन उत्पन्न करते हैं, इन्हें निलंबन संवर्धन कहा जाता है

ओर 

एक प्रकार की माध्यम है जिसमें एक एकल कोशिका या कोशिकाओं के छोटे समूह उत्तेजित माध्यम में निलंबित रहते हुए गुणा करते हैं।

• निलंबन कल्चर को सेल कल्चर के रूप में भी जाना जाता है।
• निलंबन कल्चर  कैलस कल्चर की तुलना में बहुत तेजी से बढ़ती है और इसे लगभग हर हफ्ते उपकल्चर की आवश्यकता होती है।
• यह सेल जीव विज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी में विभिन्न अनुप्रयोगों जैसे सेल लाइन रखरखाव, पुनः संयोजक प्रोटीन का उत्पादन और सेल फिजियोलॉजी और चयापचय पर अध्ययन के लिए व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है।

कोशिका निलंबन कल्चर के प्रकार

सेल सस्पेंशन कल्चर को मोटे तौर पर दो भागों में वर्गीकृत किया जाता है

A. बैच कल्चर

• यह कल्चर की एक बंद प्रणाली है जिसका अर्थ है कि कल्चरकरण की प्रक्रिया के दौरान न तो कोई सामग्री जोड़ी जाएगी और न ही हटाई जाएगी। हम अनुकूल वातावरण में कल्चर माध्यम की एक निश्चित मात्रा में कोशिका को विकसित कर सकते हैं। 
• बैच कल्चर में, माध्यम और सेलुलर संरचना में निरंतर परिवर्तन होता है।
•  निरंतर कल्चर की तुलना में बैच कल्चर अधिक सुविधाजनक हैं। बैच कल्चर का एक बड़ा दोष यह है कि कोशिकाएं एक निश्चित बिंदु तक बढ़ती हैं और फिर कोशिका वृद्धि स्थिर हो जाती है, (कल्चर माध्यम में विषाक्त मेटाबोलाइट्स के संचय के कारण) कोशिका की संख्या और आकार स्थिर रहता है, हालांकि, तेज दर पर ताजा मीडिया प्रदान करके चरण से बचा जा सकता है। 
• लेकिन यह बैच कल्चर का हिस्सा नहीं है। बैच कल्चर 4 प्रकार की होती हैं 

1. धीमी गति से घूमने वाली कल्चर ,
2. शेकर कल्चर, 
3. स्पिनिंग कल्चर, 
4. हलचल कल्चर।

B. सतत कल्चर

• यह कल्चर की एक खुली प्रणाली है जिसमें पुरानी कल्चर माध्यम लगातार नई कल्चर माध्यम के साथ बदलती रहती है ताकि बढ़ती कोशिकाओं की शारीरिक स्थिति को स्थिर किया जा सके।
• आम तौर पर, पोषक तत्वों की कमी शुरू होने पर तरल माध्यम बदल जाता है। इस प्रकार, इस पद्धति का उपयोग करके हम बैच कल्चर की कमी से बच सकते हैं।

• यह 2 प्रकार का है।

1. केमोस्टैट
2. टर्बिडोस्टैट

चरण 

1. एक्सप्लांट का चयन:

पौधे के वांछित भाग का चयन किया जाना चाहिए जो एक्सप्लांट के रूप में कार्य करता है, मुख्य रूप से पौधे का युवा ऊतक निलंबन कल्चर के लिए बेहतर होता है।

2. एक्सप्लांट का निर्जमीकरण और अलगाव

चयनित एक्सप्लांट संदूषण से मुक्त होना चाहिए जो कल्चर माध्यम में पोषक तत्वों की कमी के जोखिम को कम करता है। क्योंकि सूक्ष्मजीव कल्चर माध्यम में तेजी से बढ़ते हैं और सभी उपलब्ध पोषक तत्वों को अवशोषित करते हैं, माध्यम में संवर्धित कोशिकाओं के विकास को रोकते हैं।

3. सेल सस्पेंशन का प्रारंभिक चरण

पौधे के ऊतक पर कैली प्रारूप जो आम तौर पर कॉम्पैक्ट होता है लेकिन सबकल्चरिंग के बाद कैली भुरभुरा हो जाता है। फिर भुरभुरा कैली को ठोस माध्यम से तरल माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है।

भुरभुरी कैली अपनी शिथिल रूप से जुड़ी संरचना के कारण कोशिका निलंबन स्थापित करने के लिए आदर्श हैं और उनकी बनावट पोषक तत्वों के अवशोषण में सहायक होती है।

4. सेल सस्पेंशन को हिलाएं

2 - 4 टुकड़े फ्रिएबल कैली को एक शंक्वाकार फ्लास्क में स्थानांतरित किया जाता है। फ्लास्क के मुंह को भूरे रंग के कागज के टुकड़े से ढक दिया जाता है। साथ ही फ्लास्क को 100 - 250rpm (गोल प्रति मिनट) पर चलने वाले शेकर पर रखा जाता है।

5. सेल सस्पेंशन को छान लें

7 दिनों के बाद शंक्वाकार फ्लास्क की सामग्री को एक निष्फल छलनी छिद्र के माध्यम से छान लिया जाता है। इस छानने में केवल मुक्त कोशिकाएँ या कोशिका समुच्चय होते हैं।

6. सेल सस्पेंशन की वृद्धि

फ्रिएबल कैली संवर्धन माध्यम के वातावरण को अपनाती है और कैली का गुणन होता है। जिसे वृद्धि वक्र के माध्यम से दिखाया जा सकता है। कोशिकाओं की संख्या को हेमोसाइटोमीटर द्वारा मापा जा सकता है।

7. लक्ष्य के अनुसार उत्पादन

अंतिम चरण में, सेल सस्पेंशन का उत्पादन अनुसंधान उद्देश्य के अनुसार भिन्न होता है। मुख्य रूप से इसका उपयोग मेटाबोलाइट्स के उत्पादन और तरल माध्यम में उनके व्यवहार के अध्ययन के लिए किया जाता है।

अनुप्रयोग/ महत्व

निलंबन कल्चर के अनुप्रयोगों और महत्व की एक विस्तृत श्रृंखला है:

1. चिकित्सीय प्रोटीन, एंटीबॉडी, टीके और जैवसक्रिय यौगिकों का उत्पादन।

2. इसका उपयोग सेलुलर प्रक्रियाओं, दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण आणविक तंत्र आदि के अध्ययन के लिए भी किया जाता है।

3. निलंबन कल्चर विस्तारित अवधि में सेल लाइनों के कुशल प्रसार और रखरखाव की अनुमति देती है।

4. निलंबन कल्चरयाँ आनुवंशिक इंजीनियरिंग और पुनः संयोजक प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक उपयुक्त मंच प्रदान करती हैं।

5. निलंबन कल्चरयाँ स्तनधारी कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं हैं, बल्कि बैक्टीरिया, खमीर और कवक सहित विभिन्न माइक्रोबियल कोशिकाओं के विकास और रखरखाव के लिए भी उपयोग की जाती हैं।

लाभ

1. सस्पेंशन कल्चर को आसानी से छोटे वॉल्यूम से लेकर बड़े वॉल्यूम तक बढ़ाया जा सकता है।

2. चूंकि कोशिकाएं तरल माध्यम में होती हैं, इसलिए उनकी वृद्धि, व्यवहार्यता और चयापचय गतिविधि की निगरानी करना आसान होता है।

3. पोषक तत्व को लगातार समायोजित किया जा सकता है।

4. सस्पेंशन कल्चर में उगाई गई कोशिका रेखाएँ आमतौर पर अनुयाई कल्चरयों की तुलना में अधिक आनुवंशिक रूप से स्थिर होती हैं।

5. निलंबित कोशिकाएँ एक-दूसरे के प्रति अधिक समरूप होती हैं। जो कुछ अनुप्रयोगों के लिए फायदेमंद है।

हानि 

1. सेल सस्पेंशन कल्चर के लिए आवश्यक यांत्रिक हलचल कोशिकाओं को कतरनी तनाव के अधीन कर सकती है, जिससे संभावित रूप से नाजुक कोशिकाओं को नुकसान पहुँच सकता है या वे फट सकती हैं।

2. सस्पेंशन कल्चर के परिणामस्वरूप कुछ कोशिका कार्यों या विशेषताओं का नुकसान हो सकता है जो उस ऊतक या अंग के लिए विशिष्ट हैं जहाँ से कोशिकाएँ प्राप्त हुई थीं।

3. सस्पेंशन कल्चर में हलचल और वातन अत्यधिक झाग पैदा कर सकता है, जिससे यांत्रिक कोशिका क्षति और कल्चर प्रदर्शन में कमी हो सकती है।

4. सस्पेंशन कल्चर सूक्ष्मजीवों या अन्य विदेशी कणों द्वारा संदूषण के लिए अधिक प्रवण होते हैं, क्योंकि कोशिकाओं को बाहरी वातावरण से अलग करने वाला कोई भौतिक अवरोध नहीं होता है।

5. सस्पेंशन कल्चर को अक्सर अन्य कल्चर की तुलना में अधिक जटिल और महंगे कल्चरल मीडिया की आवश्यकता होती है।

6. सस्पेंशन कल्चर सेल-टू-सेल इंटरैक्शन या ऊतक-विशिष्ट फ़ंक्शन के अध्ययन में मदद नहीं कर सकता है।

सस्पेंशन कल्चर को प्रभावित करने वाले कारक

1. आंदोलन और मिश्रण:

 सस्पेंशन कल्चर की अच्छी वृद्धि और कतरनी तनाव और कोशिका क्षति से बचने के लिए उचित आंदोलन की आवश्यकता होती है।

2. कल्चर पोत और आकार

पोत को विकास और अन्य प्रक्रिया के लिए कोशिकाओं के लिए पर्याप्त सतह क्षेत्र प्रदान करना चाहिए।

3. कल्चर माध्यम संरचना:

माध्यम को इष्टतम कोशिका वृद्धि के लिए आवश्यक पोषक तत्व, वृद्धि कारक, पीएच बफरिंग एजेंट और आसमाटिक संतुलन प्रदान करना चाहिए।

4. तापमान और पीएच:

कोशिकाओं में वृद्धि और कार्य के लिए विशिष्ट तापमान और पीएच इष्टतम होता है। इसलिए तापमान और पीएच महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं जिन्हें निलंबन कल्चरयों में कड़ाई से नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है।

5. गैस विनिमय और ऑक्सीकरण:

कोशिका श्वसन और ऊर्जा चयापचय के लिए पर्याप्त गैस विनिमय और ऑक्सीकरण महत्वपूर्ण हैं।

6. संदूषण नियंत्रण:

सूक्ष्मजीवों, कवक या अन्य विदेशी कणों से संदूषण निलंबन कल्चरयों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकता है।

7. कल्चर की अवधि:

कल्चर की अवधि कोशिका व्यवहार, उत्पादकता और व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकती है। कल्चर की लंबी अवधि के कारण विभेदीकरण क्षमता और उत्पादकता में कमी आती है

Frequantly Asked Question

As you know the plant tissue culture is divided into two parts based on ex-plant growth those are callus culture and suspension culture. 

Suspension culture

Tissue and cell cultured in a liquid medium produce a suspension of single cells and cells columns of few to many cells these are called suspension cultures. 

Or 

A type of culture in which a single cell or small aggregates of cell multiply while suspended in an agitated medium.

• Suspension culture is also known as cell culture.
• Suspension culture grows much faster than callus culture and its needs to be subcultured about every week.
• It is a widely used technique in cell biology and biotechnology for various applications such as cell line maintenance, production of recombinant proteins, and studies on cell physiology and metabolism.

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Types of cell suspension culture 

The cell suspension culture is broadly classified into two parts i.e. 

A. Batch culture 

• It's a closed system of culture which means neither any material will be added nor removed during the process of culturing. We can grow the cell in a fixed amount of culture medium in a favourable environment. 
• In batch culture, continuous change occurs in the medium and cellular composition. 
• Batch cultures are more convenient than continuous cultures.
• One major drawback of batch cultures is that the cells grow up to a certain point and then the cell growth becomes stationary, (due to the accumulation of toxic metabolites in the culture medium) the number and size of the cell remain constant however, the phase can be avoided by providing fresh media at a faster rate. But it is not part of the batch culture. 
• Batch cultures are 4 types 

1. Slow-rotating culture
2. Shaker culture
3. Spinning culture
4. Stirred culture 

B. Continuous culture

• It's an open system of culture in which the old culture medium continuously changed with the new culture medium to stabilize the physiological state of growing cells.
• Generally, the liquid medium changed when the depletion of nutrients started. Thus, by using this method we can avoid the drawback of batch culture. 
• It's 2 types. 

1. Chemostat
2. Turbidostat 

Steps

1. Selection of explant:

The desirable part of the plant should be selected that act as an explant mainly the young tissue of the plant is better for the suspension culture.

2. Sterilization and isolation of explant

The selected explant should be free from contamination which decreases the risks of lack of nutrients in the culture medium. Because microorganisms grow rapidly in the culture medium and absorb all the available nutrients, inhibit the growth of cells cultured in the medium.

3. Initial Stage of cell suspension

The calli format over the plant tissue which generally compact but after subculturing calli become friable. Then Friable calli transferred from solid medium to liquid medium.

The Friable calli are ideal for establishing cell suspension because of their loosely attached structure and their texture favours nutrient uptake. 

4. Shake the cell suspension 

2 - 4 pieces of Friable calli are transferred into a conical flask. The mouth of the flask is covered with a piece of brown paper. Simultaneously the flask was placed on a shaker moving at 100 - 250rpm (round per minute).

5. Filter the cell suspension

After 7 days The content of the conical flask is filtrated through a sterilized sieve pore. This filtrate contains only free cells or cell aggregates. 

6. Growth of cell Suspension

The Friable calli adopts the environment of culture medium and multiplication of calli occurs. Which can show through the growth curve. The number of cells can be measured by a haemocytometer. 

7. Production according to goal 

In the final step, the production of cell suspension varies according to the research purpose. Mainly it's employed for the production of metabolites and the study of their behaviour in a liquid medium. 

Application/ Importance

Suspension culture has a wide range of applications and importance:

1. The production of therapeutic proteins, antibodies, vaccines, and bioactive compounds. 

2. It is also used for studying cellular processes, drug screening, and toxicity testing molecular mechanisms and so on. 

3. Suspension culture allows for the efficient propagation and maintenance of cell lines over extended periods. 

4. Suspension cultures provide a suitable platform for genetic engineering and recombinant protein expression. 

5. Suspension cultures are not limited to mammalian cells but are also used for the growth and maintenance of various microbial cells, including bacteria, yeast, and fungi. 

Advantages

1. Suspension cultures can be easily scaled up from small volumes to large volumes. 

2. Since cells are in a liquid medium, it is easier to monitor their growth, viability, and metabolic activity.

3. The nutrient can be continuously adjusted. 

4. Cell lines grown in suspension culture are generally more genetically stable compared to adherent cultures. 

5. Suspended cells are more homogeneous to each other. which is beneficial for certain applications.

Disadvantage

1. The mechanical agitation necessary for cell suspension culture can subject cells to shear stress, potentially damaging or rupturing fragile cells.

2. Suspension culture may result in the loss of certain cell functions or characteristics that are specific to the tissue or organ from which the cells were derived. 

3. Agitation and aeration in suspension cultures can cause excessive foaming, which may lead to mechanical cell damage and reduced culture performance.

4. Suspension cultures are more prone to contamination by microorganisms or other foreign particles, as there is no physical barrier separating the cells from the external environment.

5. Suspension cultures often require more complex and expensive cultural media compared to other cultures. 

6. Suspension culture can not help in the study of cell-to-cell interaction or tissue-specific function. 

Factor affecting Suspension culture

1. Agitation and mixing: 

Proper agitation is required for good growth of suspension culture and to avoid shear stress and cell damage.  

2. Culture vessel and size

The vessels should provide sufficient surface area for cells for growth and other process. 

3. Culture medium composition: 

The medium should provide the necessary nutrients, growth factors, pH buffering agents, and osmotic balance for optimal cell growth. 

4. Temperature and pH: 

Cells have specific temperature and pH optima for growth and function. Hence Temperature and pH are critical parameters that need to be tightly controlled in suspension cultures. 

5. Gas exchange and oxygenation: 

Adequate gas exchange and oxygenation are crucial for cell respiration and energy metabolism.

6. Contamination control: 

Contamination from microorganisms, fungi, or other foreign particles can significantly affect suspension cultures. 

7. Duration of culture:

The duration of culture can influence cell behaviour, productivity, and viability. Differentiation potential and productivity decrease due to the Long duration of culture. 

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Reference

Pundhan Singh. 2016. Objectives Plant biotechnology. Kalyani publishes, New Delhi.

https://www.biologydiscussion.com/plant-tissues/cell-suspension-culture/cell-suspension-culture-definition-principle-protocol-and-importance-plant-tissue/14601

https://www.differencebetween.com/difference-between-monolayer-and-vs-suspension-culture/

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