Embryo Culture PPT | Its Type, Importance and Application | Notes & PDF Download - Agrobotany

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Frequently Asked Questions ❓

What is Embryo Culture?

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Embryo: In plants, an embryo is a multicellular, undeveloped, and dormant stage within a seed that contains the pre-forms of organs.

Embryo Culture: A technique for regenerating whole plants from embryos under controlled conditions, first attempted by Hannig in 1904 with crucifers Cochleria and Raphanus.

Types of Embryo Culture

1. Mature Embryo Culture: Uses simple media to germinate embryos that fail to survive or become dormant in vivo.

2. Embryo Rescue (Immature Embryo Culture): Cultures immature embryos to prevent abortion in wide crosses, using complex media with amino acids, hormones, and endosperm extracts.

Embryo Culture Media

Embryo culture media provide essential nutrients and are tailored for different developmental stages:

- Fertilization Media: Promotes oocyte fertilization.

- Cleavage Media: Supports growth from one cell to the eight-cell stage.

- Blastocyst Media: Optimizes development from eight cells to over 100 cells.

Common components include carbohydrates (sucrose), amino acids (glutamine, asparagine), growth regulators (abscisic acid), natural plant products (coconut milk), and vitamins, with an optimal pH of 5-7.5. The incubation environment is controlled for temperature (25-30°C), humidity (90%), and gas mixture (CO₂, O₂, N₂).

Steps of Embryo Culture

1. Selection of Material: Embryos are carefully chosen from seeds or fruits at various developmental stages. 
2. Sterilization: Selected embryos are surface sterilized to prevent contamination. 
3. Isolation of Embryos: Mature embryos are isolated from seeds or fruits, while immature embryos are isolated from ovules.
4. Placement in Culture Medium: Embryos are placed on a sterile culture medium with endosperm for nutrition.
5. Incubation: Embryos are placed in a controlled environment for optimal development. 
6. Subculture: Periodic transfer of embryos to fresh culture media ensures continued growth. 
7. Embryo Development: Embryos progress through various developmental stages into plantlets. 
8. Rooting and Acclimatization: Plantlets are induced to root and gradually acclimatized to external conditions. 
9. Transplanting to Soil: Mature plantlets are ready for transplantation into soil, becoming self-sustaining mature plants.

Applications of Embryo Culture

1. Production of Rare Hybrids: Helps develop hybrids that fail due to poor endosperm development.

2. Disease-Resistant Plants: Produces disease-resistant plants, e.g., virus-resistant tomatoes.

3. Overcoming Seed Dormancy: Eliminates long dormancy periods in seeds like iris.

4. Shortening Breeding Cycles: Accelerates breeding cycles, e.g., roses flowering in six months instead of one year.

5. Propagation of Rare Plants: Propagates rare plants like bananas and colocasias.

Limitations of Embryo Culture

1. Low Success Rate: Variable outcomes and difficulty in ensuring consistent results.

2. Variable Nutritional Requirements: Different embryos have specific and often complex nutritional needs.

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भ्रूण संवर्धन क्या है?

भ्रूण - एक पौधे में भ्रूण एक नए पौधे का बहुकोशिकीय, अविकसित और निष्क्रिय अवस्था है जो बीज के भीतर बनता है।

भ्रूण में अंगों का पूर्व-रूप मौजूद होता है।अर्थात भ्रूण से विकसित किए गए पौधे सामान्य पौधे के समान ही होते हैं।

भ्रूण संवर्धन से तात्पर्य नियंत्रित परिस्थितियों में भ्रूण से पूरे पौधे के पुनर्जनन से है

या

विकसित हो रहे बीज  से तरुण भ्रूण को निकाल कर पोष पदार्थ पर संवर्धित करने को भ्रूण संवर्धन कहते हैं 

या

भ्रूण संवर्धन एक विशिष्ट तकनीक है जिसमें पौधों के भ्रूणों से इन विट्रो तकनीक के द्वारा नए पोधे तैयार किये जाते हैं।

हैनिग (1904) ने दो क्रूसिफ़र्स, कोक्लेरिया और राफानस के परिपक्व भ्रूणों को संवर्धित करने का पहला प्रयास किया था।

भ्रूण संवर्धन के प्रकार क्या हैं?

भ्रूण संवर्धन के 2 प्रकार हैं

1. परिपक्व भ्रूण संवर्धन:

परिपक्व भ्रूण संवर्धन के लिए सरल माध्यम की आवश्यकता होती है और यह तब किया जाता है जब भ्रूण जीवित नहीं रह पाते, वे लंबे समय तक निष्क्रिय हो जाते हैं और बीज अंकुरण के अवरोध को समाप्त कर देते हैं।

2. भ्रूण बचाव या अपरिपक्व भ्रूण संवर्धन:

अपरिपक्व भ्रूण संवर्धन को भ्रूण बचाव के रूप में भी जाना जाता है। भ्रूण गर्भपात से बचने और व्यवहार्य पौधों का उत्पादन करने के लिए व्यापक क्रॉस के भ्रूणों को बचाने के लिए अपरिपक्व भ्रूण संवर्धन का उपयोग किया जाता है। इसके लिए जटिल माध्यम की आवश्यकता होती है जिसमें विशेष अमीनो एसिड, हार्मोन, एंडोस्पर्म अर्क जैसे संवर्धन माध्यम और वृद्धि प्रेरण शामिल हैं।

भ्रूण संवर्धन मीडिया क्या है?

भ्रूण संवर्धन मीडिया एक निर्मित एवं टिकाऊ माध्यम है जो भ्रूण के विकास के लिए सभी आवश्यक पोषक तत्व प्रदान करता है।

संवर्धित भ्रूण विभिन्न अवस्थाओं पर भिन्न-भिन्न आवश्यकताएं प्रदर्शित करता है, इसलिए भ्रूण की मांग को पूरा करने के लिए अनेक माध्यमों की आवश्यकता होती है।

सामान्य तौर पर, निम्नलिखित मीडिया का उपयोग किया जाता है:

• निषेचन माध्यम: अण्डाणुओं के निषेचन को बढ़ावा देना।

• विभाजन माध्यम: भ्रूण के विकास को एक कोशिका अवस्था से लगभग आठ कोशिका अवस्था तक बनाए रखना।

• ब्लास्टोसिस्ट माध्यम: भ्रूण के विकास को आठ कोशिकाओं से 100 से अधिक कोशिकाओं या उससे भी अधिक तक अनुकूलतम बनाना

भ्रूण संवर्धन के लिए पोषण संबंधी आवश्यकताएं प्रजातियों के अनुसार अलग-अलग होती हैं, लेकिन सामान्य तत्वों में निम्नलिखित शामिल हैं:

• कार्बोहाइड्रेट: ऊर्जा और ऑस्मोलैरिटी के लिए सुक्रोज।
• अमीनो एसिड: नाइट्रोजन के लिए ग्लूटामाइन या एस्परैगिन, विशेष रूप से छोटे भ्रूणों के लिए।
• विकास नियामक: भ्रूणजन्य विकास के लिए एब्सिसिक एसिड।
• प्राकृतिक पौधे उत्पाद: कुछ अपरिपक्व भ्रूणों के लिए नारियल का दूध।
• विटामिन: संवर्धन मीडिया में उपयोग किया जाता है।
• पीएच: इष्टतम सीमा 5 से 7.5 है।
• इनक्यूबेटर में संवर्धन  का वातावरण: (1)। तापमान 25 डिग्री सेल्सियस से 30 डिग्री सेल्सियस के बीच बनाए रखा जाता है, (2)। आर्द्रता (90%), और (3)। तीन गैसों का मिश्रण; कार्बन डाइऑक्साइड (5.5%), ऑक्सीजन (5.0%), और नाइट्रोजन (89.5%)।

भ्रूण संवर्धन की प्रक्रिया/चरण क्या है?

1. सामग्री का चयन :

यह प्रक्रिया बीजों या विकासशील फलों से भ्रूणों का सावधानीपूर्वक चयन करके शुरू होती है। यह चरण दोनों प्रकार के भ्रूण संवर्धन में समान है। ये भ्रूण संवर्धन के विशिष्ट लक्ष्यों के आधार पर विकास के विभिन्न चरणों में हो सकते हैं।

 2. निर्जर्मीकरण :

संदूषण को रोकने के लिए, चयनित भ्रूणों को उपयुक्त कीटाणुनाशक, अक्सर ब्लीच और इथेनॉल के संयोजन का उपयोग करके सतह पर निर्जमीकृत किया जाता है। सूक्ष्म जीवों को निष्क्रिय करने को रोगाणुनाशन या निर्जमीकरण कहते हैं ज़ाइगोटिक भ्रूण बीज और अंडाशय ऊतक के नियंत्रित वातावरण के भीतर बहुत अच्छी तरह से संलग्न होते हैं, यही कारण है कि उन्हें सतह की निर्जमीकरण  की आवश्यकता नहीं होती है।

3. भ्रूण का अलगाव :

परिपक्व भ्रूण को फिर बाँझ / बंध्या /स्टेराइल तकनीक का उपयोग करके बीजों या फलों से सावधानीपूर्वक अलग किया जाता है। दूसरी ओर, अपरिपक्व भ्रूण को बीजांड से अनुदैर्ध्य रूप से विभाजित करके अलग किया जाता है। स्टेराइल / बंध्या बनाए रखने के लिए यह आमतौर पर लैमिनार फ्लो के तहत किया जाता है।

4. एण्डोस्पर्म के साथ संवर्धन माध्यम में रखना :

पृथक परिपक्व या अपरिपक्व भ्रूण को एण्डोस्पर्म के साथ एक बाँझ / स्टेराइल संवर्धन माध्यम पर रखा जाता है। क्योंकि एण्डोस्पर्म एक पोषक ऊतक है जो बढ़ते भ्रूण को पोषण प्रदान करता है। इसलिए, कभी-कभी एण्डोस्पर्म को माध्यम में स्थानांतरित किया जाता है। माध्यम की संरचना पहले से ही उपरोक्त प्रश्न में चर्चा की गई है।

5. इन्क्यूबेशन :

भ्रूण के साथ कल्चर डिश या कंटेनर को नियंत्रित वातावरण में रखा जाता है, आमतौर पर ग्रोथ चैंबर या इनक्यूबेटर में। यह वातावरण इष्टतम भ्रूण विकास के लिए आवश्यक तापमान, आर्द्रता और प्रकाश की स्थिति प्रदान करता है।

6.उपसंवर्धन :

समय-समय पर, भ्रूण को निरंतर वृद्धि और विकास सुनिश्चित करने के लिए नए संवर्धन माध्यम में स्थानांतरित करने की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रक्रिया को उपसंवर्धन के रूप में जाना जाता है, जो पोषक तत्वों की कमी को रोकने और स्वस्थ भ्रूण को बनाए रखने में मदद करती है।

7. भ्रूण विकास:

समय के साथ, भ्रूण पौधों में विकसित होने लगते हैं। विशिष्ट विकासात्मक चरण पौधे की प्रजाति और संवर्धन के इच्छित उद्देश्य के आधार पर भिन्न होते हैं। जाइगोटिक भ्रूण निम्नलिखित चरणों के माध्यम से विकसित होता है:

प्रो भ्रूण चरण - गोलाकार चरण - हृदय के आकार का चरण - टारपीडो चरण - कोटिलेडोनरी चरण।

8. जड़ें जमाना और जलवायु अनुकूलन:

एक बार जब भ्रूण पौधे में विकसित हो जाते हैं, तो उन्हें इन विट्रो में जड़ें जमाने के लिए प्रेरित करने की आवश्यकता हो सकती है। जड़ें जमाने के बाद, उन्हें धीरे-धीरे नमी कम करके और रोशनी के स्तर को बढ़ाकर बाहरी वातावरण के अनुकूल बनाया जाता है।

9. मिट्टी/ फिल्ड में रोपाई:

अंत में, पौधे मिट्टी में रोपने के लिए तैयार हो जाते हैं। इस स्तर पर, वे आत्मनिर्भर हो जाते हैं और उन्हें परिपक्व पौधों के रूप में उगाया जा सकता है।

भ्रूण संवर्धन का अनुप्रयोग क्या है?

• दुर्लभ संकरों का उत्पादन: भ्रूण संवर्धन दुर्लभ संकर भ्रूणों के विकास में सहायता करता है जो खराब या असामान्य एंडोस्पर्म विकास के कारण विकसित होने में विफल हो सकते हैं।
• रोग प्रतिरोधी पौधों का विकास: भ्रूण संवर्धन रोग प्रतिरोधी पौधों के विकास में सहायक है, जैसे कि टमाटर वायरस और कवक के प्रतिरोधी हैं, जिसका उदाहरण लाइकोपर्सिकॉन एस्कुलेंटम एक्स एल. पेरुवियानम संकर है।
• बीज की निष्क्रियता पर काबू पाना: भ्रूण संवर्धन तकनीक बीज की निष्क्रियता को समाप्त कर सकती है, जैसा कि आइरिस के बीजों में देखा जाता है, जिन्हें अंकुरित होने में कई साल लग सकते हैं।
• प्रजनन चक्रों को छोटा करना: भ्रूण संवर्धन प्रजनन चक्र को तेज करता है, जैसा कि गुलाब के पौधों में देखा जाता है, जिन्हें आमतौर पर फूल आने में एक साल लगता है, लेकिन भ्रूण संवर्धन के साथ, फूल केवल छह महीने में आ सकते हैं।
• दुर्लभ पौधों का प्रसार: भ्रूण संवर्धन का उपयोग केले और कोलोकेशिया जैसे दुर्लभ पौधों के प्रसार के लिए किया जाता है।

भ्रूण संवर्धन की सीमाएँ क्या हैं?

भ्रूण संवर्धन तकनीक की दो मुख्य सीमाएं हैं।  कम सफलता दर और परिवर्तनशील पोषण संबंधी आवश्यकताएं।

Embryo - an embryo in a plant is the multicellular, undeveloped, and dormant stage of a new plant organism that forms within the seed. 

The embryo contains the pre-form of the organs.

Embryo Culture refers to the regeneration of the whole plant from an embryo in controlled conditions. 

or

Embryo culture is a specialized technique that involves the in vitro cultivation and development of plant embryos. 

Hannig (1904) was made the first attempt to cultured mature embryos of two crucifers, Cochleria and Raphanus.

What are the Types of Embryo Culture?

There are 2 types of Embryo Culture

1. Mature embryo culture:

Mature embryo culture requires a simple medium and is done when embryos do not survive in vivo, they become dormant for longer periods and eliminate the inhibition of seed germination.

2. Embryo Rescue or Immature embryo Culture:

Immature embryo culture is also known as embryo rescue. The culture of immature embryos to rescue the embryos of wide crosses is used to avoid embryo abortion and produce viable plants. It requires complex media which include special amino acids, hormones, endosperm extract like culture medium and induction of growth. 

What is Embryo Culture Media?

Embryo Culture media is a created and sustainable medium provides all essential nutrients for the development of embryo.

The cultured embryo exhibit differ requirements on different stages, there for, a number of media is required to satisfies the demand of embryo.

Typically, following media is utilised:

• Fertilization Media: To promote fertilization of oocytes. 
• Cleavage Media: To sustain growth of embryo from the one cell stage to around the eight cell stage. 
• Blastocyst Media: To optimise the development of embryo from eight cells to well over 100 cells or further.

Nutrition requirements for embryo culture vary by species, but common elements include:

• Carbohydrates: Sucrose for energy and osmolarity.
• Amino acids: Glutamine or asparagine for nitrogen, especially for younger embryos.
• Growth regulators: Abscisic acid for embryogenic development.
• Natural plant products: Coconut milk for certain immature embryos.
• Vitamins: Utilized in culture media.
• pH: Optimal range is 5 to 7.5.
• Culture environment in incubator : (1). Temperature maintained between 25°C to 30°C, (2). humidity (90%), and (3). A mixture of three gases; carbon dioxide (5.5%), oxygen (5.0%), and nitrogen (89.5%). 

What are the Process/Steps of Embryo Culture?

1. Selection of material 

The process begins by carefully selecting embryos from seeds or developing fruits. This step is common in both types of embryo culture These embryos can be at various stages of development, depending on the specific goals of the culture.

2. Sterilization

To prevent contamination, the selected embryos are surface sterilized using a suitable disinfectant, often a combination of bleach and ethanol. The Zygotic embryo are very well enclosed within the sterile   environment of the ovular and  ovary tissue that's why they do not require surface sterilization. 

3. Isolation of Embryos

The mature embryos are then carefully isolated from the seeds or fruits using sterile techniques. The immature embryo, on the other hand, isolated from ovule by split longitudinally. This is typically done under a laminar flow hood to maintain sterility.

Embryo nurse endosperm transplant:

4. Placement in culture medium with Endosperm

The isolated mature or immature embryos are placed on a sterile culture medium with endosperm. Because Endosperm is a nutritive tissue which provide nutrition to growing embryo. Hence, some times endosperm is transfer to the medium. The composition of the media is allready discussed in above question. 

5. Incubation:

The culture dishes or containers with the embryos are placed in a controlled environment, typically in a growth chamber or incubator. This environment provides the necessary temperature, humidity, and lighting conditions for optimal embryo development.

6. Subculture:

Periodically, the embryos may need to be transferred to fresh culture media to ensure continued growth and development. This process, known as subculture, helps to prevent nutrient depletion and maintain healthy embryos.

7. Embryo Development:

Over time, the embryos start to develop into plantlets. The specific developmental stages vary depending on the plant species and the intended purpose of the culture. The Zygotic embryo develop through following stages:

Pro embryo Stage - Globular stage - Hearted shaped stage - Torpedo stage - Cotyledonary stage. 

8. Rooting and Acclimatization:

Once the embryos have developed into plantlets, they may need to be induced to root in vitro. After rooting, they are gradually acclimatized to the external environment by reducing humidity and increasing light levels.

9. Transplanting to Soil:

Finally, the plantlets are ready to be transplanted into the soil. At this stage, they have become self-sustaining and can be grown into mature plants.

What are the Applications of Embryo Culture?

1. Production of rare hybrids: Embryo culture aids in the development of rare hybrid embryos that may fail to develop due to poor or abnormal endosperm development.
2. Development of disease-resistant plants: Embryo culture is instrumental in the evolution of disease-resistant plants, such as tomatoes resistant to viruses and fungi, exemplified by Lycopersicon esculentum X L. peruvianum hybrids.
3. Overcoming seed dormancy: Embryo culture techniques can eliminate seed dormancy, as observed in iris seeds which may take several years to germinate.
4. Shortening of breeding cycles: Embryo culture accelerates the breeding cycle, as seen in rose plants which typically take one year to flower, but with embryo culture, flowering can occur in just six months.
5. Propagation of rare plants: Embryo culture is employed for the propagation of rare plants like bananas and colocasias.

What are Limitations of Embryo Culture?

There are two main limitations of the embryo Culture technique, viz., low success rate and variable nutritional requirements.

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Reference

Pundhan Singh. 2016. Objectives Plant biotechnology. Kalyani publishes, New Delhi.

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